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超聲照射對(duì)人胚腎細(xì)胞凋亡的影響
超聲照射對(duì)人胚腎細(xì)胞凋亡的影響
【摘要】 目的 了解診斷超聲照射對(duì)體外培養(yǎng)的人胚腎(HEK?293)細(xì)胞凋亡的影響。
方法 HEK?293細(xì)胞用腹部超聲探頭(3.5 MHz、MI 0.8)照射0、10、20、30 min，再作Hoechst 33258染色，觀察細(xì)胞凋亡的變化。
結(jié)果 超聲照射10 min后，細(xì)胞凋亡率與假照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);超聲照射20 min后，細(xì)胞凋亡率明顯高于假照組(P<0.05)，其中以照射30 min較為顯著(P<0.01)。
結(jié)論 特定劑量的超聲照射可誘導(dǎo)人胚腎細(xì)胞凋亡增加。
【關(guān)鍵詞】 超聲;凋亡;形態(tài)學(xué)
Abstract: Objective To investigate the effect of diagnostic ultrasound exposure on the apoptosis of human embryonic kidney (HEK?293) cells. Methods HEK?293 cells were exposure to abdominal ultrasound probe for 0, 10, 20 and 30 min, and their apoptosis was detected by Hoechst 33258 staining. Results Compared with control group, apoptotic rate of HEK?
293 cells increased significantly after 20?min exposure (P<0.05), especially after 30?min exposure (P<0.01). However, there was no statistical difference in apoptotic rate between 10?min exposure group and control group (P>0.05).Conclusion The dose of dia?gnostic ultrasound exposure can induce the apoptosis of HEK?293 cells.
Key words:ultrasound; apoptosis; morphology
超聲應(yīng)用于產(chǎn)科，可以推算胎齡、診斷先天畸型及了解胎兒宮內(nèi)發(fā)育情況，它能為胎兒、胚胎甚至正在發(fā)育成熟的卵泡提供一個(gè)清晰的圖像，同時(shí)也需要更高的超聲輸出功率。
隨著孕前卵泡檢測和產(chǎn)前檢查越來越細(xì)致和精確，超聲運(yùn)用的頻率、時(shí)間、輸出功率也在不斷增加，敏感的胚胎組織及生殖細(xì)胞受到的威脅也隨之加大。
人們對(duì)超聲使用的安全性也越發(fā)關(guān)心。
有關(guān)產(chǎn)科超聲的安全性，目前尚無統(tǒng)一定論，更無具體的輻照劑量可引起哪方面的影響這樣的規(guī)律可循，孕期超聲檢查只能盡可能地使用最低劑量。
這使超聲的產(chǎn)前檢查安全性的遵循原則帶有盲目性，或者引起因不了解超聲的安全范圍而濫用超聲，為產(chǎn)前檢查帶來隱患。
要明確知道產(chǎn)前超聲的安全范圍還需要一個(gè)漫長的過程，本實(shí)驗(yàn)擬探討超聲近距離輻照對(duì)體外培養(yǎng)細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變的影響，為產(chǎn)前超聲的安全使用提供一定的理論依據(jù)。
1 材料和方法
1.1 試劑
Hoechst 33258購自美國Sigma公司，DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，胎牛血清(FBS)購自杭州四季青生物工程公司，胰蛋白酶購自美國Gibco公司，其余試劑為國產(chǎn)分析純。
HEK?293細(xì)胞株由廣東醫(yī)學(xué)院生化教研室提供。
1 mg Hoechst 33258溶解于10mL PBS中，配成100 mg/L的10×Hoechst 33258儲(chǔ)存液，密封避光，4℃短期保存。
1.2 儀器
MCO?15A CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(日本SANYO公司)，YJ?875DA 醫(yī)用凈化工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠)，IMT?I型熒光顯微鏡(日本OLYMPUS公司)，Vivid 7彩色多普勒超聲診斷儀(GE公司)。
1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與處理
HEK?293細(xì)胞采用常規(guī)培養(yǎng)方法，無血清饑餓培養(yǎng)調(diào)整細(xì)胞周期一致后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
將細(xì)胞分成超聲照射0 、10、20、30 min組，空白組予以假照，腹部探頭產(chǎn)科診斷條件(3.5 MHz、MI 0.8)，介質(zhì)為細(xì)胞培養(yǎng)液(主要成分為DMEM培養(yǎng)基)，輻照距離<1 cm，處理后繼續(xù)培養(yǎng)24h后檢測。
1.4 細(xì)胞染色與觀察
收集處理后的細(xì)胞，PBS洗滌離心2次后取10μL細(xì)胞懸液滴于蓋玻片上，加1mL固定液(甲醇∶冰乙酸3∶1)，4℃固定5 min，棄去固定液，用PBS洗兩遍，吸盡液體。
加入1mL Hoechst 33258工作液(10 mg/L)，搖床輕搖，染色10 min，棄去染色液，用熒光顯微鏡避光拍照，激發(fā)波長350 nm左右，發(fā)射波長460 nm左右。
1.5 結(jié)果評(píng)判
細(xì)胞凋亡過程中細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變分為三期：Ⅰ期的細(xì)胞核呈波紋狀或呈折縫樣，部分染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài);Ⅱa期細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化;Ⅱb期的細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。
由兩位病理學(xué)技術(shù)人員對(duì)圖片進(jìn)行分析對(duì)照。
1.6 凋亡百分率的計(jì)算
把載波片置于24孔板培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞爬片，調(diào)整周期及分組照射(方法同1.3)后培養(yǎng)24h，5mg/L的Hoechst 33258避光染色5min，熒光顯微鏡觀察。
計(jì)算每孔5個(gè)高倍(×400)視野平均細(xì)胞總數(shù)、凋亡細(xì)胞數(shù)，最終算出細(xì)胞凋亡百分率。
1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
計(jì)量數(shù)據(jù)以(±s)表示，使用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，多個(gè)樣本均數(shù)的比較采用單因素方差分析及q檢驗(yàn)。
2 結(jié)果
2.1 HEK?293細(xì)胞體外培養(yǎng)
HEK?293體外培養(yǎng)成功，經(jīng)傳代培養(yǎng)后，待細(xì)胞生長疏密適中，于倒置相差顯微鏡下進(jìn)行放大倍數(shù)為600倍拍照，光鏡下HEK?293細(xì)胞的形態(tài)呈多角形，貼壁生長，細(xì)胞間有連接，細(xì)胞核圓形或橢圓形，大小約占整個(gè)細(xì)胞的1/3，核內(nèi)染色質(zhì)及核仁清晰，部分可見分裂相。
2.2 凋亡細(xì)胞Hoechst 33258染色的形態(tài)學(xué)變化
空白組：超聲處理0 min(假照)，細(xì)胞核大小較一致，核膜完整，核內(nèi)染色質(zhì)呈小點(diǎn)狀均勻分布，部分可見有絲分裂相，未見異型核，見圖1。
1組：超聲處理10 min，細(xì)胞核形態(tài)尚規(guī)則，核膜完整，未見異形核，但對(duì)比空白組，本組細(xì)胞核部分出現(xiàn)大小不一，核內(nèi)染色質(zhì)聚集的現(xiàn)象，見圖2。
2組：超聲處理20 min，細(xì)胞核大小不均，一部分細(xì)胞核脹大，染色質(zhì)邊集，一部分細(xì)胞核縮小濃染，呈小顆粒狀，個(gè)別細(xì)胞核膜不完整，染色質(zhì)疏松，表現(xiàn)為凋亡Ⅰ期和Ⅱa期改變，見圖3。
3組：超聲處理30 min，細(xì)胞核大小不均，部分可見異形核的出現(xiàn)，部分細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)濃染邊集，呈小團(tuán)塊狀，個(gè)別核膜破裂染色質(zhì)疏松分布于胞質(zhì)中，表現(xiàn)為凋亡Ⅱa期和Ⅱb期改變，見圖4。
圖1圖2圖3圖4
圖1 空白組細(xì)胞Hoechst 33258染色結(jié)果(×600);圖2 超聲照射10 min組細(xì)胞Hoechst 33258染色結(jié)果(×600);
圖3 超聲照射20 min組細(xì)胞Hoechst 33258染色結(jié) (×600);圖4 超聲照射30 min組細(xì)胞Hoechst 33258染色結(jié)果(×600)。
2.3 細(xì)胞凋亡率比較
詳見表1。
3 討論
細(xì)胞凋亡是多細(xì)胞有機(jī)體為保持自身組織穩(wěn)定、調(diào)控自身細(xì)胞的增殖和死亡之間的平衡、由基因控制的細(xì)胞主動(dòng)性死亡過程。
細(xì)胞凋亡的主要特點(diǎn)為：細(xì)胞體積小，染色質(zhì)濃縮，呈塊狀致密染色區(qū)，DNA分子被特異性DNA內(nèi)切酶在核小體間切斷，核裂解，形成凋亡小體[1]。
生殖細(xì)胞、受精卵和胚胎組織中，即便是個(gè)別細(xì)胞出現(xiàn)異常的凋亡，都有可能對(duì)其生長發(fā)育造成影響。
因此超聲對(duì)細(xì)胞凋亡的影響受到學(xué)者們的關(guān)注。
bcl?2是一種重要的凋亡抑制因子，周海燕等[2]研究證明，長時(shí)間連續(xù)超聲照射可引起胎鼠腎小管上皮表1 不同劑量的超聲作用HEK?293細(xì)胞凋亡百分率的改變細(xì)胞bcl?2蛋白表達(dá)水平下降。
p53基因在誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡時(shí)有重要的作用，趙晶等[3]研究表明，超聲輻照時(shí)間和劑量的增加可引起p53基因的蛋白表達(dá)水平增加。
何明生等[4]發(fā)現(xiàn)，電壓為10 mV條件下超聲輻照K562細(xì)胞10 min以上，輻照組細(xì)胞形態(tài)變化較大，核染色質(zhì)濃縮呈斑塊狀，并有核碎裂、凋亡小體出現(xiàn)。
有學(xué)者發(fā)現(xiàn)低頻超聲輻照HL?60后細(xì)胞膜空隙率增加，這可能是凋亡前的形態(tài)學(xué)改變[5]。
Lagneaux等[6]則認(rèn)為低頻超聲效應(yīng)與聲化學(xué)機(jī)制有關(guān)，超聲誘導(dǎo)的聲化學(xué)冷光能觸發(fā)光敏感性單態(tài)氧的產(chǎn)生，從而對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生一個(gè)“氧化應(yīng)激”，繼而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡反應(yīng)。
一般以細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變?yōu)橹笜?biāo)來評(píng)判細(xì)胞凋亡的進(jìn)展情況，常用的DNA特異性染料有Hoechst 33258，它能與DNA非嵌入式結(jié)合，主要結(jié)合在A?T堿基區(qū)，紫外光激發(fā)時(shí)發(fā)射明亮的藍(lán)色熒光，從而對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行形態(tài)學(xué)的觀察。
Hoechst 33258凋亡染色法具有直觀，方便的優(yōu)點(diǎn)，并可通過形態(tài)學(xué)的變化對(duì)其凋亡的早中晚期進(jìn)行估測。
本實(shí)驗(yàn)用Hoechst 33258對(duì)空白組和處理組細(xì)胞染色后，經(jīng)熒光顯微鏡觀察，與凋亡形態(tài)的標(biāo)準(zhǔn)相符合，其中超聲處理30 min組部分細(xì)胞核染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化并產(chǎn)生了凋亡Ⅱb期的形態(tài)學(xué)改變，部分細(xì)胞核呈異形核，細(xì)胞核形態(tài)改變最明顯，細(xì)胞凋亡比例最高(P<0.01)。
而超聲處理20 min組的細(xì)胞，部分出現(xiàn)了凋亡Ⅰ期的細(xì)胞核呈波紋狀或呈折縫樣和Ⅱa期染色質(zhì)濃縮的狀態(tài)，也出現(xiàn)了一定數(shù)量的凋亡細(xì)胞(P<0.05)，說明超聲的長時(shí)間聚焦照射可以對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生一定的傷害。
從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，達(dá)到或超過20 min的超聲照射可以引起HEK?293細(xì)胞部分凋亡及凋亡前期的形態(tài)改變。
【參考文獻(xiàn)】
[1] Vaux D L. Toward and understanding of the molecular mechanism of physiological cell death [J]. PNAS, 1993, 90(3): 786?789.
[2] 周海燕, 段云友, 楊繼慶. 彩色多普勒超聲照射對(duì)中孕胎鼠腎小管上皮細(xì)胞bcl?2蛋白表達(dá)的影響[J]. 中國醫(yī)學(xué)影像技術(shù), 2004, 20 (5): 683?685.
[3] 趙晶，段云友，賈化平. 晚孕期彩超重復(fù)照射對(duì)胎鼠中樞神經(jīng)P53蛋白表達(dá)及超微結(jié)構(gòu)的影響[J]. 中國醫(yī)學(xué)影像技術(shù), 2005, 21(5): 1169?1171.
[4] 何明生, 曹紅花, 朱念麟, 等. 超聲誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究[J]. 中國超聲醫(yī)學(xué)雜志, 2006, 22(10): 724? 726.
[5] Ogawa K, Tachibana K, Uchida T, et al. High?resolution scanning electron microscopic evaluation of cell?membrane porosity by ultrasound[J]. Med Electron Microsc, 2001, 34(4): 249?253.
[6] Lagneaux L, de Meulenaer E C, Delforge A, et al. Ultrasonic low?energy treatment: A novel approach to induce apoptosis in human leukemic cells[J]. Exp Hematol, 2002, 30(11): 1298?1301.
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